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荧光定量PCR技术的原理和应用
天根生化科技产品目录   2014年09月30日07:54
 

荧光定量PCR技术的原理和应用

实时荧光定量PCR技术(Real-Time PCR)是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化。

定量原理

荧光定量PCR技术涉及到三个基本?#25293;睿?/P>

基线(Baseline)

是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,这样的直线即是基线。

荧光阈值(Threshold)的设定

一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光阈值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍,荧光阈值设定在PCR扩增的指数期。

CT

表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。研究表明,各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小,反之亦然。利用已知起拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表CT值。因此,只要获得未知样品的CT值,?#32431;?#20174;标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

实时荧光定量PCR的特点

1.特异:荧光定量PCR具有引物(染料法)和探针(探针法)的双重特异性,故与传统的PCR相比,特异性大为提高。

2.敏感:荧光定量PCR的敏感度通常高达102拷贝/ml,对数期分析,线性范围很宽,为0-1011拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-1010拷贝,在此范围内荧光定量PCR定量较为准确,标本不需稀释。

3.重复:荧光定量PCR结果相当稳定,因为阈值设置在指数扩增期。在次阶段,各反应组分浓度相对稳定,CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更稳定,更精确地反应起始模板?#30446;?#36125;数。

4.安全:无PCR后续操作步骤,降低产物污?#38236;?#39118;险性。

实时荧光定量PCR的应用范围

1.核酸的定量:如RNA、DNA的定量。

2.核酸定性分析:如SNP分析,基因型分析,RNA变异分析,溶解曲线分析等。

 
 
 
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